Virusii din familia Orthomyxoviridae sunt reprezentati de particule in principal ovoide, dar avand un pleiomorfism foarte accentuat, ele pot aparea atat sub forma sferica cat si globuloasa sau chiar filamentoasa. Aceste particule sunt de dimensiuni medii, cuprinse intre 80-120 nm si sunt protejate de o capsida si o pericapsida.
Pericapsida este alcatuita dintr-un bistrat lipidic dispus central, derivat din membrana plasmatica a celulei gazda, si un strat proteic la interior (proteina M1). Aceasta are rolul de a impacheta noile segmente de ARN produse in celulele infectate si de a le transporta la periferia celulei, in vecinatatea membranei, pentru a forma un nou virus ce va fi eliberat in organism.
Anvelopa virala prezinta 500 de spiculi de 2 tipuri: HA (hemaglutinina) si NA (neuraminidaza), distribuiti uniform spre exterior. Acestia sunt prezenti la suprafata intr-o proportie de 4-5:1. Ca si lipidele, o parte din proteinele prezente in pericapsida sunt provenite din celula gazda, dar mai ales cele din invelisul extern sunt virus-specifice. Homeopeplosul este constituit din componentele virus-specifice, iar heteropeplosul este reprezentat de catre elementele derivate din structura chimica a celulei gazda. Spiculii de la suprafata pericapsidei fac parte din homeopeplos, fiind structuri virus-specifice. Acestia sunt implantati cu terminatia hidrofoba in bistratul lipidic prin legaturi necovalente, astfel incat sa fie posibila reorientarea acestora la suprafata pericapsidei in functie de interactiunile cu celula tinta.
Hemaglutinina este o structura glicoproteica de forma liniara ce agrega pentru a forma un trimer cu lungimea de 135A de la punctul sau de insertie in pericapsida pana la varf. Privit la microscopul electronic acesta apare sub forma unui baston prismatic cu baza triunghiulara. Hemaglutinina are proprietatea de a fixa molecule de acid sialic (N-acetil- neuraminic) la extremitatea sa distala. Hemaglutinina (HA) este descompusa prin clivaj proteolitic in doua portiuni: HA1 (47kd) si HA2 (29kd) care sunt legate intre ele prin punti bisulfidice; cum fiecare dintre cei trei monomeri sunt alcatuiti dintr-un lant HA1 si un lant HA2, in urma clivajului vor rezulta un numar de 6 molecule, 3 de HA1 si inca 3 de HA2.
In prima etapa a atacului viral, hemaglutinina leaga reziduuri de acid sialic din receptorii proteici glicozilati de pe suprafata celulei tinta, legandu-se de aceasta si declansand procesul de endocitoza.
Fragmentul HA1 este implicat in fuziunea veziculara mediata prin valoarea pH-ului endozomal. Rolul acestei particule este acela de a produce fuziunea membranelor virale cu cele ale celulei gazda dupa endocitoza. Aceasta etapa poate fi realizata datorita valorii scazute a pH-ului endozomal, cuprins intre 5 si 6, ce determina modificari conformationale in molecula de HA. Consecinta functionala a acestor modificari este translocarea unor grupari terminale din molecula de HA2 (portiune denumita extremitatea N - de la "new" sau "nou" deoarece aceasta este exact extremitatea nou obtinuta prin clivajul moleculei de HA) pe membrana endosomala, formand o structura stabila, cu forma electronomicroscopica de alfa-helix, avand o lungime de 110A, una dintre cele mai lungi intalnite in orice proteina. Acest alfa-helix este puntea de legatura formata intre virus si membrana endozomala.
Pe fiecare monomer hemaglutininic sunt localizate 4 situsuri antigenice. Datele experimentale sugereaza ca pana si simpla substituire a unui singur aminoacid la nivelul oricaruia dintre aceste situsuri duce la transformarea antigenica a particulei virale, si, in consecinta, nerecunoasterea acesteia de catre sistemul imunitar.
Neuraminidaza este o enzima de natura glicoproteica ce are la randul ei si un rol antigenic. Multe dintre cele 9 subtipuri apar mai ales la pasari, dar N1 si N2 au fost implicate in pandemii de gripa umana. Chiar si N3-N7 au fost legate de cateva decese sporadice in randul populatiei.
Ea mai este cunoscuta si ca sialidaza sau acetil-neuraminil hidrolaza. Aceasta enzima catalizeaza hidroliza terminatiilor reprezentate de catre molecule de acid N-acetil-neuraminic legat α 2-3, α 2-6 sau α 2-8 la molecule glicoproteice sau oligozaharidice. S-a observat o afinitate mai redusa pentru acidul sialic legat in pozitie α 2-8 fata de primele doua pozitii.
Imaginea electronomicroscopica a neuraminidazei este asemanatoare ca forma cu o ciuperca, capul acesteia fiind format din 4 subunitati coplanare si relativ sferice, iar piciorul este reprezentat de o regiune hidrofoba implantata in bistratul lipidic al pericapsidei virale. Pentru aceasta molecula, regiunea hidrofoba este reprezentata de catre o terminatie amino. Neuraminidaza este alcatuita dintr-un singur lant polipeptidic ce este rasucit in sens invers fata de moleculele de hemaglutinina. Din punct de vedere chimic lantul polipeptidic este alcatuit dintr-un numar de 6 aminoacizi polari fixi, urmati de variatii de aminoacizi hidrofili.
Functia acesteia este legata de eliberarea particulelor virale nou formate din celulele infectate, prin scindarea acidului sialic terminal prezent pe unele dintre catenele glucidice de la suprafata acestor celule. Totodata, aceasta are si rol protector pentru celula gazda o data ce aceasta a fost invadata. Molecula de neuraminidaza este una din primele proteine virus specifice produse de catre celula gazda in timpul multiplicarii intracelulare a virusului. Ca si celelalte molecule ea se indreapta spre membrana celulara, unde se acumuleaza, impiedicand atasarea altor particule virale la aceeasi celula.
Particula virala prezinta de asemenea canale ionice, sau proteina M2. Aceste canale strabat pericapsida si capsida, principalul lor rol fiind acela de a permite cresterea aciditatii la interiorul virionului in perioada in care acesta este contentionat in endozom. ARN-ul viral poate fi eliberat din matricea proteica virala ( proces denumit "uncoating", "decapsulare") doar daca pH-ul creste anterior fuziunii membranei virale la membrana endozomala. Eliberarea ARN-ului este datorata minimalizarii interactiunilor dintre proteinele ribonucleice (de exemplu polimeraza ARN- dependenta care nu este codata de catre genomul celulei gazda) si cele matriceale. De asemenea, aceste canale ionice functioneaza si in timpul exocitozei echilibrand gradientul de pH dintre lumenul acid al aparatului Golgi si citoplasma cu pH neutru.
Un alt rol indeplinit de catre proteina M2 doar la unele subtipuri virale este prevenirea unor modificari conformationale premature ale moleculei de hemaglutinina HA, tot prin modificarea pH-ului complexului Golgi.
Canalele ionice actioneaza prin proprietatea lor de a conduce ioni de H+, iar ca mecanism de control conductibilitatea canalelor este redusa de valori scazute ale pH-ului din virion (feed-back negativ).
Proteina M2 pare sa aibe si un rol complet distinct, acela de ligant pentru asocierea proteinei M1 la structurile pericapsidei in cursul asamblarii noilor particule virale.
Structura proteinei M2 codificata prin secventa primara de aminoacizi este reprezentata de un polipeptid cu 97 de radicali, avand in domeniul transmembranar un numar de 19 aminoacizi iar in cel intracitoplasmatic 54 de aminoacizi. Terminatiile cisteinice se intalnesc la radicalii 17 si 19, acestia fiind responsabili de formarea dimerilor si tetramerilor. Totusi, simplul fapt ca un tetramer se formeaza nu inseamna si ca acesta este forma activa oligomerica a substantei, dar in urma cercetarilor de laborator s-a dovedit ca intr-adevar forma tetramerica a moleculei este responsabila pentru activitatea acesteia.
Una din grupele principale de medicamente antivirale este reprezentata de cele din familia amantadinelor. Amantadina actioneaza asupra proteinei M2, inhiband functionarea acesteia si blocand astfel ciclul replicativ al virusului. Din acest punct de vedere proteina M2 este foarte importanta pentru cercetatori si medici, antiviralele din aceasta grupa fiind una din putinele solutii terapeutice pe care le avem momentan la dispozitie in lupta cu virusul gripal. Totusi, nici acesta nu se lasa mai prejos decat cei mai prestigiosi cercetatori ai momentului, in Asia existand deja un procent ingrijorator de ridicat (31% din tulpinile H5 si 11% dintre tulpinile H9) de tulpini rezistente la amantadina. Noua tulpina H1N1 responsabila pentru pandemia din acest an este si ea rezistenta la amantadina.
Rezistenta la amantadina este cauzata de substituirea unui aminoacid din domeniul transmembranar al proteinei. Aceasta mutatie poate surveni in oricare din cele 5 situsuri implicate, efectul fiind acelasi, mutatia aparuta la unul singur dintre cele 5 situsuri (diferiti aminoacizi) fiind suficienta pentru instaurarea rezistentei la aceste antivirale.
Protonii transportati prin aceste canale trebuie sa treaca printr-un por hidrofil ce are selectivitate pentru protoni. Din moment ce aceasta proteina are o structura tetramerica in forma sa activa, singura locatie posibila pentru acest por este reprezentata de spatiul dintre domeniile transmembranare ale monomerilor proteinei M2. In urma cercetarilor s-a stabilit ca aceste domenii transmembranare au cel mai probabil forma helicoidala. Concluzia a fost acceptata pe baza mai multor dovezi: in primul rand, mutatiile rezistentei la amantadina apar la distanta de 3-4 radicali de-a lungul proteinei; in al doilea rand, spectrul cristalografic circular este potrivit unei structuri α-helicoidale; in cel de-al treilea rand, cand s-a realizat scanarea mutagena cu cisteina s-a observat ca inlocuirea fiecarui al treilea sau al patrulea radical din molecula duce la mari perturbari in proprietatile canalului (radicalii care au dus la cele mai grave alterari dupa preschimbarea lor in terminatii cisteinice au fost V27, A30, S31, G34, H37 si W41).
A fost testata si ipoteza conform careia tocmai radicalii aceia ar fi orientati spre lumenul canalului ionic, cu ajutorul unor reagenti disulfidici specifici solubili in apa: metan-tiosulfonat-metilamoniu (MTSEA) si metan-tiosulfonat-tetraetilamoniu (MTSET). Acesti reagenti au fost aplicati pe oocite care prezentau fiecare dintre cele 19 mutatii substitutive cu cisteina in domeniul transmembranar. Cand acesti reagenti au fost aplicati extracelular (portiunea N-terminala a proteinei) s-a observat ca A30C (Ala30-alanina, aminoacid situat in pozitia 30) si G34C (Gly34) au fost inhibate la aplicarea MTSEA. [Shuck et al., 2000].
Modificarile inregistrate nu sunt reversibile, faptul ca ele se pastreaza si dupa spalarea reagentilor ducand cu gandul la niste modificari covalente. Fenomenele de inhibitie nu au fost detectate la radicalii aflati mai aproape de capatul extracelular al canalului decat Ala30, indicand un diametru mai mare al porului la deschiderea exterioara a acestuia.
Cand reagentii au fost aplicati intracelular prin injectie in oocite s-a observat ca mutantii W41C (Trp41) au fost inhibati, dar nu si cei G34C. Astfel s-a confirmat ipoteza potrivit careia 4 dintre radicali se gasesc la interiorul lumenului canalelor ionice, tapetandu-le ca o mucoasa. Faptul ca G34C a putut fi inhibat prin aplicarea extracelulara a reagentului dar nu si prin aplicarea intracelulara a indicat ca trebuie sa existe o strictura pe lungimea porului intre radicalii 34 si 41 care determina imposibilitatea patrunderii reagentului. Se banuieste ca strictura canalelor ionice transmembranare este localizata la nivelul histaminei din pozitia 37 (His37), dar aceasta ipoteza nu a putut fi transformata in certitudine deoarece mutantii de tip H37C (in care histidina este substituita de cisteina) nu prezinta activitate ionica. Totusi His37 este considerat filtrul selectiv al canalelor ionice virale. [Shuck et al., 2000].
Histidina prezinta o catena secundara de imidazol ce este capabila sa coordoneze anumite metale tranzitionale. Acest fapt nu este numai un avantaj pentru particula virala ci poate fi o veritabila arma impotriva sa, de cand cercetatorii au observat ca tulpinile salbatice (fara mutatii de rezistenta la antivirale) sunt puternic inhibate de ionii de Cu 2+ (insa nu si de cei Cu 1+). Totusi tulpinile mutante de tip M2H37A sunt inhibate doar slab si rapid reversibil. [Gandhi et al., 1999].
Examinarea secventei de aminoacizi din domeniul transmembranar al canalului ionic releva ca exista un singur radical cu abilitatea de oxido-reducere (cedare si acceptare de electroni sau H+) intre valorile pH-ului la care canalul este activ. Acest radical este tot His37. Mai mult decat atat, acest radical a fost indicat ca fiind pozitionat la interiorul lumenului canalului ionic si este situat chiar la nivelul stricturii acestuia. La inlocuirea acestui radical (M2 WT - molecula nemodificata) cu glicina (M2 H37G), alanina (M2 H37A) si acid glutamic incarcat negativ (M2 H37E) s-a constatat ca activitatea canalelor mutante este relativ independenta de pH (intensitatea curentilor transmisi prin por nu a fost modificata semnificativ de variatiile ph-ului). [Wang et al., 1995]. Mai mult decat atat, s-a evidentiat faptul ca mutantele substituite cu acid glutamic nu au abilitatea de a fi proton-selective, cum sunt canalele ionice nemodificate. Acest fapt a dus la concluzia ca His37 este implicata in activarea canalului ionic la valori scazute ale pH-ului.
Faptul ca protonii nu sunt doar transportati pasiv ci interactioneaza cu canalele ionice (sau cel putin cu unul dintre radicalii care le tapeteaza) a fost dovedit prin compararea conductibilitatii canalului cu un solvent normal apos si cu deuteriu ca solvent. Rezultatele au depasit gradientul de vascozitate dintre deuteriu si apa. [Mould et al., 2000].
Din aceste rezultate experimentale s-au obtinut datele necesare pentru a valida modelul molecular al domeniului transmembranar (TM) calculat pana atunci doar pe baza principiului de minim energetic. Conform acestui model Ala30, Gly34, His37 si Trp41 tapeteaza lumenul canalelor ionice. [Shuck et al., 2000].
Virusii de tip Influenza B necesita si ei etapa de acidifiere inaintea decapsularii (uncoating). Acest fapt a fost demonstrat pentru prima oara in 1991 de catre Zhirov. Virionii de tip B lizati cu o solutie de tip detergent nu elibereaza ARN in solutie la pH neutru dar ARN-ul este eliberat la valori scazute ale pH-ului mediului.
Ca si proteina M2 a tulpinilor de tip A, proteina BM2 este si ea capabila de acidifiere. Oocitele sau celulele de mamifere care au fost expuse in solutii cu valori scazute ale pH-ului s-au acidifiat mai rapid cand exprimau proteina BM2 decat celulele martor sau celulele ce exprimau o proteina mutanta in care radicalul histidina din domeniul transmembranar era inlocuit cu cisteina. Din nefericire, amantadina nu inhiba proteina BM2 deoarece lumenul acesteia este tapetat cu alti radicali decat aceia ai proteinei AM2. Histidina (H) si Triptofanul (W) au acelasi locus in ambele catene, acest fapt corespunzand cu teoriile inaintate pana acum despre rolul esential jucat de acestea in functionarea acestor canale.
Genomul viral este reprezentat printr-un complex ribonucleoproteic (RNP) alcatuit din 8 segmente distincte de ARN cu polaritate negativa (complementar cu ARN-ul mesager) si 3 polimeraze PA, PB1 si PB2, asociate fiecarui segment. Genomul este alcatuit din 8 segmente doar in cazul tipurilor A si B, unde acestea codifica 10 proteine, dar in cazul virionilor de tip C, ARN-ul este reprezentat de doar 7 segmente ce codifica 9 proteine.
| Segment | Marime (nt) | Polipeptide | Functie |
| 1 | 2341 | PB2 | Transcriptaza: legarea la extremitatea libera a ARN-ului celulei gazda. (87 kd) |
| 2 | 2341 | PB1 | Transcriptaza: elongatie. (96 kd) |
| 3 | 2233 | PA | Transcriptaza: activitate catalitica. (85 kd) |
| 4 | 1778 | HA | Hemaglutinina |
| 5 | 1565 | NP | Nucleoproteina: transporta intranuclear si intracitoplasmatic fragmente de ARN, invelindu-le. (60 kd) |
| 6 | 1413 | NA | Neuraminidaza |
| 7 | 1027 | M1 | Proteina de membrana |
| M2 | Canale ionice | ||
| 8 | 890 | NS1 | Proteina Non-Structurala: transportul celular al ARN-ului, translatie. Proteina anti-interferon. |
| NS2 | Non- Structurala: functie necunoscuta |
Lungimea totala a genomului viral este de 12.000 -15.000 de nucleotide, iar masa moleculara a acestuia fiind proportionala cu dimensiunile si masa virionului, aceasta mai depinzand si de cantitatea de informatie stocata.
Secventa genomului prezinta o repetitie a capetelor terminale, identice intre ele. La secventa terminala 5' aceasta portiune repetitiva este lunga de 13 nt, ea fiind identica cu portiunea repetitiva intalnita la secventa 3', desi aici poate fi mai scurta. Aceasta este considerata a fi o secventa de incapsidare si ea lipseste din ARN-ul mesager (UTR - untranslated region). Secventele repetitive sunt alcatuite pe langa nucleotidele terminale cu o conservabilitate ridicata (nu se intalnesc modificari la acest nivel) si din nucleotide specifice segmentului, neconservate. Aceste secvente repetitive sunt identice in cadrul aceluiasi tip viral, si asemanatoare chiar si intre diferitele tipuri de influenza, sugerand ca virusii de tip A, B si C au o origine comuna. Cele 3 polimeraze (PB1, PB2 si PA) se regrupeaza impreuna in citoplasma si migreaza spre nucleu pe masura ce sunt produse. Toate trei prezinta semnale cariofilice si se gasesc in numar de 30-60 in fiecare virion.
Polimeraza PB2 indeplineste si un rol de bariera interspecifica, radicalul 627 din structura acesteia fiind mereu glutamat in tulpinile cu patogenitate pentru speciile aviare si lizina in cele cu patogenitate pentru om. Totusi, in urma cercetarilor efectuate in acest sens, inlocuirea acestui radical nu face tulpinile aviare patogene si pentru alte specii in afara de om, deci se impune teoria existentei mai multor astfel de radicali ce determina patogenitatea pentru o anumita specie gazda.
Cel mai mic fragment al genomului viral, segmentul 8, este responsabil de sintetizarea celor 2 proteine non-structurale NS1 si NS2, codificate fiecare prin segmente diferite de ARN mesager.
Proteina NS1 actioneaza ca supresor al sintezei de interferon B, iar deletia acesteia duce la exprimarea unui fenotip atenuat. Plecand de la calcule legate de masa moleculara redusa a segmentului s-a demonstrat ca nu este loc suficient pentru cele 2 secvente decat daca acestea sunt suprapuse. Dupa ce banuiala a fost confirmata pe modele virtuale, secventierea completa a segmentului 8 a dovedit suprapunerea celor doua codoane dincolo de orice speculatie.
Codoanele sunt suprapuse pe o distanta de la 43 la 60 de aminoacizi, in functie de care locus metioninic (dintre cele 4 posibilitati viabile) initiaza inceperea sintezei de NS2. Sinteza de NS1 este initiata de nucleotidele A U G din pozitiile 27-29 (din totalul de 890 ce alcatuiesc intregul segment 8) si este incheiata de secventa U G A din pozitiile 717-719. Pe baza greutatii moleculare de aproximativ 11kd pentru NS2, metionina care initiaza sinteza acesteia ar putea fi localizata pe pozitia 1, 3, 6 sau 18 si este prezentata in chenar in harta genomului. Suprapunerea la acest nivel poate fi descrisa si ca fiind de lungimea a 127-179 de nucleotide (cele care codifica cei 43-60 de aminoacizi mentionati anterior). [Porter et al., 1990].
Mecanismul intern de initiere a transcriptiei pentru ARN-ul mesager al NS2 se bazeaza pe recunoasterea de catre transcriptaza a unei secvente similare cu secventa 3' conservata la toate cele 8 segmente virale. Exista 2 secvente similare dar in urma cercetarilor si mai ales a calculelor privind marimea necesara a secventei ce codifica NS2 s-a concluzionat ca secventa repetitiva cu valoare de recunoastere pentru transcriptaza este localizata de la nucleotida 488 la 499, 8 din cele 12 nucleotide fiind identice cu cele prezente in secventa repetitiva terminala 3'.
Pe harta genomului segmentului 8 (prezentata pe urmatoarea pagina) este expus si ARN-ul complementar.
